速效救心丸对鸡胚尿囊膜血管生成的影响

冯玲   胡元会   陈双厚   刘瑞华

（中国中医科学院广安门医院，北京，100053）

摘要：目的：研究速效救心丸对鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成的影响。方法：利用CAM模型，选取重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为阳性对照药，观察速效救心丸对CAM周围一级、二级与总血管数的影响。结果：速效救心丸大、小剂量组对CAM一级、二级与总血管数均有明显的促进作用，与生理盐水和正常大鼠血清组比较有显著性差异（P＜0.01），但不及阳性对照组（P＜0.01）；在一级血管促进方面，速效救心丸大剂量组优于小剂量组（P＜0.01）。在促进二级与总血管数方面，速效救心丸大、小剂量组之间无统计学差异（P>0.05）。结论：速效救心丸对对鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成有明显的促进作用。

关键词：速效救心丸；鸡胚尿囊膜（CAM）模型；血管新生

治疗性血管新生被形象地称之为“药物促进的心脏自身搭桥”，目前已成为治疗冠心病的新选择之一。血管新生及其治疗性应用在基础研究方面取得了巨大的进展,国外已开始早期的临床研究。筛选血管生成活性物质可利用内环境与人体相似且血管新生的过程易于观察的动物模型来检测，鸡胚绒毛尿囊膜模型（Chorioallantoic Membrane，CAM）简单、方便、观察指标明确，是目前较常用的促血管生成药物的体内模型[1、2]。已有大量的临床和实验研究证实速效救心丸防治冠心病疗效肯定,可以很好地改善症状和心肌缺血，提高患者生存质量，而促血管新生可能是其治疗冠心病的另一机制。我们采用了CAM模型,观察了速效救心丸对血管生成的影响，以期从另一个层面阐明速效救心丸治疗冠心病的作用机理。

1. 材料和方法

1.1材料

1.1.1 试验药物和试剂

速效救心丸由天津中新药业集团股份有限公司第六中药厂生产（国药准字Z12020025）；重组牛碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grouth factor,bFGF)由珠海亿胜生物制药有限公司生产（国药准字SI0980077， 63000iu/15ml/瓶）；甲基纤维素M-450: 北京华博科技开发中心（971104）。

1.1.2试验器材

CO2培养箱（池本理化工业株式会社生产）；净超工作台（北京昌平长城空气净化工程公司）；Nikon-D200照相机（日本）。

1.1.3试验动物　

鸡胚:50g－70g孵化1周的白皮来航鸡种蛋由中国农科院家禽所提供。清洁级Wistar大鼠20只，雌雄各半，体重180-200g,由中国医学科学院动物研究所提供。

1.2方法

1.2.1含药血清的制备

将20只Wistar大鼠随机分为3组：速效救心丸大剂量组、速效救心丸小剂量组、正常血清组。速效救心丸大剂量组：按20mg /mL制成溶液（相当于人用量的20倍），以2ml灌胃，2次/日；速效救心丸小剂量组：按10mg /mL制成溶液（相当于人用量的10倍），以2ml灌胃，2次/日；正常血清组：以0.9％氯化钠，以2ml灌胃，2次/日。三组大鼠连续灌胃7天，于末次灌胃后2h，从股动脉取血，以3000rpm离心10分钟，分离血清，用无菌滤器：（¢0.2µm）过滤，分装置于-20℃冰箱中冻存备用。

1.2.2 甲基纤维素膜的制备

甲基纤维素粉1 g，溶于100m L无菌蒸馏水，10磅10分钟灭菌，室温保存。配制成1%的甲基纤维素溶液，取75μL该溶液平铺于无菌96孔板，上下午各一次，60℃烘干，制成膜待用。

1.2.3鸡胚CAM模型的建立

将种蛋清洗2次，于 1∶1 000 新洁尔灭中浸泡 3 min 后放入 37℃孵化箱，相对湿度65%，种蛋气室向上，翻转种蛋1次/小时，至孵蛋第 7 d，在照蛋灯下观察种蛋生长情况，剔除未受精卵。用解剖针在气室顶端扎1小洞，可使鸡胚的尿囊绒毛膜与鸡蛋的内壳膜分开。照蛋灯下寻找胚头,在受精卵距胎头前 1 cm、两条前卵黄静脉之间的卵壳投影部位标记 1.0 cm×1.0 cm的正方形区域，用砂轮沿这个区域磨切透卵壳至蛋壳表面划刻出凹痕,轻揭凹陷处蛋皮,轻轻撕掉内壳膜,此时可见该处CAM连同鸡胚下陷,假气室形成(区别于自身的气室)。用透明胶带纸封贴假气室, 形成透明观察窗，继续放入37℃孵化箱孵化一天。  

1.2.4 给药方法

CAM制备24h后，将鸡胚随机分为5组：速效救心丸大剂量组、速效救心丸小剂量组、正常血清组、bFGF阳性对照组（重组牛碱性成纤维细胞生长因子，60 iu/20 μl）、生理盐水组，每组各25只，轻轻撕掉透明胶带纸，取直径约0.5cm的混合纤维素微孔滤膜片(预先高压灭菌)作为载体，置于正对观察窗的CAM表面，避开大血管，用无菌加样器吸取各组相应的药液滴于载体表面中央，前3个组分别滴加不同药物的含药血清20μl于载体上，后2个组直接加药20μl于载体上，无菌透明胶封窗，标记后再放入 37 ℃的孵箱内孵育 3 d。

1.2.5 标本的采集及观察

加药 3 d 后（鸡胚发育第12天），去除透明胶带纸，将甲醇与丙酮各半的固定液滴入观察窗，将CAM固定，去除鸡胚，分离观察窗周围CAM，固定20分钟后，以载体为中心将 CAM平铺在滤纸上并保存。在自然光线下,用Nikon尼康Coolpix E5000数码相机近距离模式拍照,放大2－3倍。并在解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管,以实验部位边缘(即微孔滤膜载体边缘)1 mm范围内为一级血管,以实验部位边缘5 mm处为二级血管,凡属趋向性生长的血管,即为载体从中心发出,与滤膜半径的夹角小于45度者均予计数,而穿行、绕行的血管则不算在内。一、二级血管分别观察计数。

1.2.6 统计学处理

实验数据以均数±标准差 (X±s )表示, 采用SPSS11.0 for windows软件包进行统计，采用方差分析，P<0.05为统计学有显著性差异。

2. 结果

表1 速效救心丸对CAM一级血管血管生成的影响表 (X±s)

由上表可见，正常血清组与生理盐水组比较，无统计学差异（P>0.05），说明正常血清组对CAM一级血管无促进作用；速效救心丸大、小剂量组对CAM一级血管生成均有明显的促进作用，与生理盐水和正常大鼠血清组比较有显著性差异（P＜0.01），但不及阳性对照组（P＜0.01）；速效救心丸大剂量组优于小剂量组（P＜0.01）。

表2 速效救心丸对CAM二级血管血管生成的影响表 (X±s)

由上表可见，正常血清组与生理盐水组比较，无统计学差异（P>0.05），说明正常血清组对CAM二级血管无促进作用；速效救心丸大、小剂量组对CAM二级血管生成均有明显的促进作用，与生理盐水和正常大鼠血清组比较有显著性差异（P＜0.01），但不及阳性对照组（P＜0.01）；速效救心丸大剂量组与小剂量组无统计学差异（P>0.05）。

表3 速效救心丸对CAM总血管生成的影响表 (X±s)

由上表可见，正常血清组与生理盐水组比较，无统计学差异（P>0.05），说明正常血清组对CAM总血管数无促进作用；速效救心丸大、小剂量组对CAM总血管数生成均有明显的促进作用，与生理盐水和正常大鼠血清组比较有显著性差异（P＜0.01），但不及阳性对照组（P＜0.01）；速效救心丸大剂量组与小剂量组无统计学差异（P>0.05）。

不同药物组对CAM血管生成直观图

生理盐水组

             正常血清组                  

bFGF组

            速效小剂量组              

速效大剂量组

3. 讨论

CAM法是国内外公认的初筛抗血管和促血管生成药物的最理想的体内实验模型之一。利用CAM模型进行血管生成的研究,国内主要集中于抑制血管生成方面，而在促进血管生成研究方面还处于起步阶段，最近几年在治疗冠心病的中药中，利用CAM模型探讨治疗性血管新生作用有了较快的发展。通过本实验研究体会到鸡胚绒毛尿囊膜法简单、方便、价格便宜，是较理想的模型，但实验过程中应注意以下几点：1. 必须在照蛋灯下照射观察种蛋生长情况，找到胎头并标记开窗位置；2. 合适的温度、湿度是种蛋孵育的必要条件。可在培养箱中放一小烧杯水，转蛋1次/小时，保持湿度在45%-70%，温度在37. 0℃±1℃之间；3. 制备假气室是实验成功的关键，可用解剖针在蛋气室表面扎1小洞，用小球囊吸出里面的空气，使鸡胚的尿囊绒毛膜与鸡蛋的内壳膜分开，然后再轻揭凹陷处蛋皮,使该处CAM下陷、形成假气室；4.保证样本量足够大，以避免假阴性或假阳性结果。

本实验采用了鸡胚绒毛尿囊膜模型（CAM），研究了速效救心丸对CAM血管新生作用的影响，结果显示：速效救心丸对CAM的血管生成有明显的促进作用，初步显示速效救心丸有促血管新生作用。速效救心丸为治疗冠心病的常用中成药，由川芎、冰片等组成，具有行气活血,祛瘀止痛的作用，用于气滞血瘀型心绞痛，因本药起效迅速，还可用于心绞痛急性发作。川芎为中医最常用的活血化瘀药，被尊称为“血中之气药”，《本草纲目》记载：川芎“上达巅顶，下通血海，中开郁结”，说明了川芎辛温走窜，既具有行气止痛、又有活血化瘀的功能。 冰片开窍醒神、辟秽化浊，使瘀化窍通、心脉痹阻得以转机。并可倍增川芎活血化瘀、行气止痛之功。促进川芎有效成分的吸收。 二药相合，正切中冠心病心绞痛、心肌梗塞的气滞血瘀、胸阳痹阻之病因病机。既往研究表明速效救心丸有明显的抗心肌缺血作用、抗动脉粥样硬化与心肌细胞保护作用[3、4]，通过本实验又初步证实了速效救心丸有明显的促血管新生作用。从另一个层面阐明了速效救心丸治疗冠心病的作用机理。

参考文献

1.MorrisAD, Leonce S, GuilbaudN, etal. EriochromeBlackT, structur-ally related to suramin, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo[J].AnticancerDrugs, 1997, 8(8): 746-55.

2.贾雷,王彦厚. 鸡胚绒毛尿囊膜在血管生成活性研究中的应用.齐鲁药事，2006，25

（6）：353-355.

3.陈卫平,赵树仪,祝君梅.速效救心丸药理作用[J].中成药,1994,16(1):31-33.

4．冯玲，韩涛，周玉萍.速效救心丸治疗冠心病心绞痛临床疗效总结，中国中医急症，2000（9）1：4-6